白酒生产中高效降解糠醛微生物的筛选与鉴定

　　糠醛又称呋喃甲醛，是重要的杂环类有机化合物。糠醛类化合物已经在白酒、葡萄酒、黄酒中检测到。在白酒中，酱香型白酒的糠醛含量最高。在白酒生产中，原料玉米、高粱、稻壳等含有的多缩戊糖在低pH值下在蒸馏过程中水解为戊醛糖，戊醛糖进一步脱水环化生成糠醛。研究发现，糠醛对酵母菌的生长具有一定的抑制作用，影响原料出酒率。

　　研究结果表明，酱香型白酒在蒸馏过程中产生的大量糠醛，并没有完全蒸馏至酒中，在酒醅中有着较高的残留。在酱香型白酒酒醅堆积过程中，糠醛含量大量减少，堆积后，糠醛的含量降低，有的可以降解至出池酒醅的水平。不少研究表明，微生物可以利用糠醛发酵产生糠醇。因此，研究酱香型白酒堆积过程糠醛降解微生物，对进一步明晰酱香型白酒的堆积机理，缩短堆积时间，提高酱香型白酒的出酒率具有重要意义。

　　1材料与方法

　　1.1材料与设备

　　酒醅  某白酒厂堆积6d的酱香型酒醅，取样后于－20℃保存； 糠醛、糠醇、2—辛醇，色谱纯；糠醛、氯化钠、氯化苄，分析纯； 限制性内切酶、Taq DNA Po lym erase、dNTP（25mmo l/L）、ITS 引物。
    　

　　气相色谱质谱联用仪( GC 6890—5975 MSD ) ；PCR 仪( PC300 )  EppendorfM aster persona；l电泳仪、凝胶成像仪 B IO—RAD；冷冻高速离心机3K 15 美国Sigma—A ldrich公司； 扫描电子显微镜  FE IQuanta 200。

　　1.2 培养基及培养条件

　　1.2.1  平板分离培养基

　　以糠醛为唯一碳源的培养基：糠醛5g，KNO3 10g，N aCl 5g，琼脂20g，加去离子水至1000mL，调节pH 到5.5，于121℃湿热灭菌30min。

　　1.2.2  摇瓶培养基 酒醅浸提液：50g 酒醅中加入100mL离子水，超声30min，离心后抽滤，共收集3次。在酒醅浸提液中添加适量糠醛，摇瓶培养糠醛降解菌。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 菌种分离 

　　在灭菌后的三角瓶中盛入适量酒醅，添加去离子水，用玻璃珠打散后浸泡过夜，三角瓶口覆盖有纱布。将酒醅浸泡液梯度稀释涂布于分离平板上，置于37℃培养箱中。

    　1.3.2 菌种鉴定 

　　采用氯化苄抽提真菌DNA：培养液离心抽滤后，收集菌丝体，转入5mL离心管中，加入0.7mL 提取液（100mmo l/L Tris—HCl， pH9.0；40mmol /L EDTA，pH 8.0），1mL 10% SDS，1.5mL 氯化苄，剧烈振荡使其成乳状，50℃保温1h。加入1.2mL 3mmol/L的NaAc，冰浴15min，6000r/min离心15min，取上清液。加入等体积的异丙醇， 0.1倍体积的0.3mol/L NaAc，10000r/m in 离心10min，弃上清液，再加入200uLTE 溶解，100uL苯酚，100uL氯仿抽提，混合均匀，在12000r/m in 下离心5m in。取上清液于另一1.5mL 离心管中，进行酚—仿抽提2次—3次。加入上清液等体积的异戊醇，在12000 r/min下离心5min。取上清液于另一1.5mL 离心管中，加入2.5倍— 3倍体积的无水乙醇，放入冰浴30min，于16000r /m in下离心2m in，弃上清液，用70% (v/v)100uL乙醇沉淀，16000r/min下离心2min。去上清液，倒置至干，加40uLTE 于－20℃中放置过夜，0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    　采用通用引物ITS1和ITS4扩增整个ITS序列，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank数据库，利用Blasta工具进行序列比对，对目的菌株进行鉴定。

    　1.3.3  色谱条件

　　用Agilent GC 6890—5975MSD对样品进行鉴定，通过DB—Wax毛细管柱进行分离。

    　程序升温条件为50℃保持2min，然后10℃/min升温至230℃，保持1min。进样口温度为250℃，载气为高纯度He；流速为2mL/min。分离后的样品用Agilent 5975MSD鉴定。质谱条件：E I电离源；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；扫描范围：35amu—350amu。

    　1.3.4  标准曲线的绘制

　　以酒醅浸提液作为标准品配制。取合适浓度的糠醛、糠醇的标样，添加到适量酒醅浸提液中。以2—辛醇为内标，使用二氯甲烷进行微萃取。萃取相通过GC—MS 分析，制作标准曲线。

    　1.3.5  糠醛及糠醇的定量　

　　通过检出物质谱图和N IST05a.L Database中标准谱图的比对，以及通过添加标准品进行验证。以2—辛醇为内标，经过GC—MS检测后，将待测物质和内标的相对峰面积比代入相对应的标准曲线方程，计算出待测物质在酒醅浸提液中的含量。

　　2 结果与分析

　　
    　2.1 菌株的筛选

    　在以糠醛为唯一碳源的分离培养基平板上进行筛选，经过分离、纯化，从酒醅样品中分离出了一株霉菌，将该菌株接种于添加了一定量糠醛的酒醅浸提液中摇瓶培养，发现菌株繁殖生长速度较快。通过对酒醅浸提液的成分检测，发现糠醛含量随着菌株的大量繁殖而迅速减少，且糠醇含量增多。

    　2.2 分离菌株的鉴定

    　2.2.1 菌株的ITS rDNA 测序结果 将利用氯化苄抽提基因组的方法进行测序。
    　扫描电镜下，其分生孢子长椭圆形，呈长链着生， 断开后两端平载，结果基本符合宛氏拟青霉分生孢子的特征。

    　2.2.２ 菌株的鉴定　

　　将利用氯化苄抽提基因组方法所得的ITSrDNA序列提交到GenBank 数据库，利用Blasta工具进行序列比对，对目的菌株进行鉴定。

　　鉴定结果为宛氏拟青霉Paecilomyces variotii。该菌株在泥土、室内环境、植物、动物和食品中普遍存在。它是一个耐热真菌，繁殖速度快，且能够在低氧以及存在防腐剂的环境中生长。

　　目前， 国内外学者在降解糠醛菌种的驯化和筛选方面进行了大量研究。

3 结论 

　　本实验从酱香型白酒酒醅中筛选出了一株高效降解糠醛的菌株，利用氯化苄抽提基因组的方法可以有效地鉴定出该菌株为宛氏拟青霉。

　　通过对降解过程的底物糠醛及产物糠醇的定量分析可以发现，该菌株降解糠醛速度快，为高效降解糠醛菌。宛氏拟青霉对酒醅中糠醛降解为糠醇有较大影响，从而证明了降解糠醛过程中微生物的作用。