新工艺黄酒种曲培养研究
黄酒是世界上最古老的酒种，其独特的发酵工艺在世界酿酒中独树一帜，加上悠久的历史底蕴，被誉为“天下一绝”。黄酒自古以来就有“欲酿酒必先制曲”的说法，绍兴酒酿造中更是把曲形象地称为“酒之骨”。可见曲对酒质具有极其重要的作用。
曲的主要作用有三个方面：一是为酒母和醪提供酶源，使原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等溶出和分解；二是在曲菌繁殖和产酶的同时，产生葡萄糖、氨基酸、维生素等成分，这是酵母的营养来源，并生成有机酸、高级醇及脂类成分；三是曲香及曲的其他成分作为酒的前体物质赋予酒以独特的风味。
本文以本公司技术中心保藏的米曲霉为菌种，研究了培养条件与种曲产孢子数的关系，与黄酒同行共同探讨、学习。
1.材料和方法
1.1 实验菌种
公司技术中心保藏的黄酒酿造用米曲霉菌种，采用麸皮试管形式保藏。
1.1.1 实验仪器
显微镜 JNO EC XS-212-201 上海医用光学仪器厂
血球计数板 （XB-4-25） 上海医用光学仪器厂
超净工作台 SB-JC-1A 上海博迅实业有限公司
湿热灭菌锅 YXQ-SG46-280SA 上海佳胜实验设备有限公司
霉菌培养箱 MJX-250B I型 上海博迅实业有限公司
1.2 培养基
1.2.1 分离培养基：蛋白胨 1.75g；琼脂粉 5g；可溶性淀粉 7.5g；水 250ml。
1.2.2 米曲汁斜面培养基：10—12。BriX米曲汁500ml；琼脂 10g。
1.2.3 麸皮试管培养基：采用麸皮为原料，加水55%－60%，每支装入试管的1/4，121℃灭菌30min。
1.3 实验方法
1.3.1 米曲霉菌种的分离、纯化
实验所用菌种为上一年保藏的菌株，性能可能发生衰退，活性减弱，因而必须对其进行纯化复壮，使其保持较强的生长繁殖能力和较高的酶活力。采用透明圈法挑选性能优良的菌种，转接入米曲汁斜面试管，30℃恒温培养4天，待孢子浓密时，置4℃冰箱中，备用。
1.3.2 米曲霉种曲的培养及分析
将麸皮用20目/寸筛过筛，筛去粉末，否则经蒸煮后会出现结块现象，造成培养时透气性不好。按实验设计进行配料，装入500ml三角瓶中，扎牛皮纸包口于湿热灭菌锅内121℃灭菌30min。取出后趁热摇散培养基，以防结块。自然冷却至室温。
取培养好的米曲汁斜面试管1支，无菌条件下接种到500ml三角瓶培养基中1环，充分摇匀。放入30℃培养箱恒温培养，经16 -20小时，麸皮上略长白色菌丝，根据生长情况每隔4小时左右摇瓶一次，若干次后根据生长情况将麸皮平摊瓶的底部。再经10小时左右麸皮连接成饼状，要求能扣则扣瓶。轻扣轻放后继续培养，每隔12小时复扣一次，至接种后取出进行分析。
分析方法：取干燥种曲0.2g，用100ml无菌水稀释，充分振荡摇匀，取中间液层，用血球板记数法测其孢子数，每瓶做两次重复。
2.结果与分析
2.1 菌种的分离纯化
透明圈法是常用的菌种分离纯化方法。对米曲霉菌落的透明圈比值进行测定，结果见表1。
由表1可以看出，当菌落稀释到10-4至10-7，菌落彼此分离，为单孢子菌落。挑选透明圈比值较大的分离出的菌落为优质纯化菌落。
将单孢子菌落转接于米曲汁斜面试管中，于30℃恒温条件下培养4天，待孢子浓密时取出，置于4℃冰箱中备用。
2.2 加水量对种曲质量的影响
水是一切生物活动的载体，种曲培养过程中米曲霉需以体外吸收养分，而养分又必须先被水所溶解，在其生长过程中又需耗掉大量的水分。本实验设计含水量70%、75%、80%、85%、90%五个梯度，接种孢子后于30℃恒温培养72小时。加水量对种曲孢子数的影响如图2所示。
由图2可知，加水量对种曲质量有显著的影响，随着培养基料中加水量的增大，种曲产孢子数呈现先增大后下降的趋势。加水量为80%~85%时，曲料比较松散，米曲霉生长旺盛，产孢子数为最高，是适宜的加水量。曲料中加水量过少（<80%），曲料缺乏水分，米曲霉对原料利用不够充分，繁殖能力降低，因而产孢子数较少；但曲料中的水分过多（>85%），曲料就会粘结成团块，引起局部散热困难，造成曲料温度不均匀，导致米曲霉生长不理想，从而影响种曲质量。
2.3 培养时间对种曲质量的影响
种曲培养时间对种曲质量有影响，过筛的新鲜麸皮80%左右的水充分拌匀，分装于500ml的三角瓶中，上棉塞包扎牛皮纸，0.1MPa湿热杀菌30min，趁热摇散瓶中热块，冷却后在无菌条件下接入试管斜面米曲霉孢子，充分摇匀。种曲培养时间与产孢子数的关系见图3。
由图3可知，随着培养时间的延长，米曲霉产孢子数呈增大趋势。在72小时后孢子数趋向平稳。
3.小结
本次实验验证了种曲培养过程中，培养基中的加水量和培养时间对种曲产孢子数的影响，确定了在黄酒种曲生产过程中培养基含水量和培养时间，对生产有很大的帮助。其余麸皮的质量等因素尚有待于进一步实验。