内标法和外标法在啤酒低沸点风味物质检测中的应用
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1 外标法
外标法，又称校正曲线法，指在相同分析条件下，用已知的标准品配成不同浓度的标准溶液，测量各种浓度的峰高或峰面积，以绘制响应信号与浓度的关系曲线。在同样条件下，测量样品的峰高或峰面积，在校正曲线上查出其对应的样品浓度；或利用样品和标准峰高、峰面积，根据回归曲线方程计算出对应的样品浓度。
2 内标法
内标法，指在样品中加入内标物，利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量。用已知的标准品和内标物配成不同浓度的标准溶液，求得校正因子比值；用测量样品的峰高、峰面积和校正因子比值计算出样品浓度。
二、材料与方法
1 仪器装置
Varian气相色谱仪配有FID检测器；
AutoHs自动顶空采样仪；
电子天秤（0.0001），微量自动吸样器、100mL容量瓶、1mL刻度吸管。
2 材料和试剂
色谱纯试剂分别为：无水乙醇、5%乙醇、乙醛、异戊醇、正丙醇、异丁醇、甲醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、甲酸乙酯、DMS
3 色谱条件
毛细管柱：DM-WAX色谱柱（30m×0.53mm×2ｕm）。
进样口温度：200℃；检测器温度：230℃；载气：氮气（6mL/min）分流比1：10。
色谱柱升温程序：40℃保温3min，10℃/min升温至90℃保温1min，30℃/min升到220℃保温3min。
4 内标液的配制
4.1 准确称取正丁醇原液20.0g于100mL容量瓶中，用色谱纯无水乙醇定容于100.0mL，此为内标原液。
4.2 取1.0mL内标原液+4.0mL色谱纯无水乙醇用重蒸水稀释至100.0mL（2000PPM），此为内标使用液。
5 风味成分混合原液的配制（见表1）
5.1 称取表1所列次序的各风味物质于100mL容量瓶中，用色谱醇无水乙醇定容摇匀，再吸取1mL混合。
标准于100mL容量瓶中定容，之后再稀释100倍即为我们所需标准。
6 试验方法
6.1 内标法
6.1.1 内标方法的建立
取5mL混标移入20mL顶空瓶中，加入0.1mL内标液，将瓶塞密封，在顶空进样器中55℃保温30min。在3色谱条件下顶空进样分析，用内标法校正，建立内标方法（见图1）。
6.1.2 样品测定
取室温下的啤酒样品5mL移入20mL顶空瓶中，加入0.1mL内标液，同上顶空进样分析，加载6.1.1已经建立的内标方法计算出样品中各风味物质的浓度。
6.2 外标法
6.2.1 外标方法建立
取5mL混标，瓶塞密封，在3色谱条件下顶空进样分析，用外标法校正，建立外标方法，计算出各组分的校正系数，保存方法备用。气相色谱法外标法测定啤酒风味物质标样（见图2）。
6.2.2 样品测定
取室温下的啤酒样品5mL移入20mL顶空瓶中，同上顶空进样分析，加载6.2.1已建立的外标方法计算样品中各组分的浓度。
三、结果与讨论
1 精密度和重复性试验
1.1 内标法精密度和重复性实验
取同一浓度混标按内标法进行三次重复检测（见表2）。
从表2可以看出，用内标法测定的结果变异系数均小于3%，说明该方法精密度和重复性都很好，符合气相色谱微量分析的要求。
1.2 外标法精密度和重复性试验
取同一浓度混标按外标法进行三次重复检测（见表3）。
从表3可以看出，用外标法测定结果变异系数相比内标法均偏高，但均小于3%。说明该方法的精密度和重复性较好，符合气相色谱微量分析的要求。
2 回收率试验
2.1 取5.0mL样品+0.1mL混标+0.1mL内标使用液，用内标法进行测定，计算回收率（见表4）
从表4可以看出，同一样品回收率测定结果均在90—105%之间。在色谱分析中是可以接受的，可以满足日常分析要求。
2.2 取5.0mL样品+0.1mL混标，用外标法进行测定，计算回收率（见表5）
从表5可以看出，同一样品回收率测定结果均在90—105%之间，在色谱分析中是可以接受的，可以满足日常分析要求。
3 不同公司样品用外标法和内标法的测定结果（见表6）
从表6可以看出，同一样品用不同的方法检测得出的结果有所偏差，尤其是含量较大的，如乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇等偏差较大。所以在选择方法时，应根据实际情况选择适宜的方法。
图3和图4是气相色谱法检测百威10.5度啤酒风味物质内标法和外标法色谱图。
4 混标放置时间长短对内标法检测结果的影响
4.1 混标放置时间长短对内标法检测结果的影响（见表7）
从表7可以看出，放置时间越长，检测结果差别越大，特别是如乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇等含量较大的物质，随着放置时间长短的不同，测定结果会随之升高。
4.2 混标放置时间长短对外标法检测结果的影响（见表8）
从表8可以看出，和内标法一样，随着放置时间越长，检测结果差别越大，特别是如乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇等含量较大的物质，随着放置时间长短的不同，测定结果随之升高，导致测定结果误差较大。
5 外界环境温度对内标法检测结果的影响
5.1 外界环境温度对内标法检测结果的影响（见表9）
从表9可以看出，仪器室内温度越高，检测结果越不稳定，同时，乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇等含量较大的物质随室内温度的升高，测定结果亦随之升高。
5.2 外界环境温度对外标法检测结果的影响（表10）
从表10可以看出，仪器室内温度越高，检测结果越不稳定。同时，乙醛、乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇和异戊醇等含量较大的物质随室内温度的升高，测定结果随之升高。
四、结论
1.用内标法和外标法测定啤酒中风味物质精度都可以达到要求，切实可行。
2.外标法操作比较简单，内标法操作比较繁琐。每次都需要添加内标液，但用内标法测定的结果比外标法要低，误差小。尤其对于含量较高的醇和酯，用内标法比外标法结果误差小。所以如果进行科研，则采用内标法较准确；如果用于工业生产，则采用外标法相对方便易行。但无论用何种方法比较数据，都要在相同的方法和相同的条件下比较，否则就没有可比性。
3.无论是用内标法还是外标法，样品放置时间的长短都会对结果产生较大的影响。放置时间越长，测定结果的误差越大。主要原因是由于放置过程中环境对其影响较大。另外，因取样时取样瓶中混入氧气，也会对部分物质如乙醛等产生不利影响，主要是因为大部分啤酒企业在啤酒过滤时添加亚硫酸盐等抗氧化剂，其分解的SO2（也包括啤酒发酵时产生的）能与乙醛形成加合物，可以减少游离乙醛的含量。但当SO2被啤酒中溶解氧氧化后，乙醛又会游离出来。这就是啤酒在放置一段时间后，乙醛含量比最初升高的原因，使乙醇发生可逆反应。生成乙醛放置时间的长短，对乙醛、乙酸乙酯、异戊醇测定结果影响较大。
4.不管采用哪种方法，环境温度对做样结果影响都比较大。温度越高，测定结果就偏高。因此在夏天做样时，须分批将样品放入，不可一次将一天的样品同时放置于取样器样品盘上，暴露于环境温度下。如果条件允许的话，最好在室内安装空调，将温度稳定在20℃做样。 如果确需将样品一次取完，可将样品先放置于0—4℃的冷藏下放置，在做样之前取出，放到进样器设好的位置。这样可使结果更准确可靠。
五、注意事项
1.保证进样量、色谱分析条件严格不变。
2.做样前，将取样瓶和瓶盖在烘箱中烘烤30min，冷却后使用。
3.样品在密封入取样瓶后，尽快分析检测，不宜放置时间过长，防止氧化使检测结果偏高。
4.为保证做样准确，减少误差，样品最少要做3个以上的平行样，取三个样品的平均值，测定结果会更准确，误差更小。
5.标准样品使用完之后，密封严实在冰箱0—4℃条件下保藏，防止挥发。
6.建议标准样品使用一个月后，重新配制。
7.标准方法应定期校正新建，以保证测定结果的准确性。
