解析绍兴黄酒麦曲中真菌的分离鉴定
麦曲在黄酒酿造中起着重要的作用。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理顺麦曲中的微生物与产地环境的相互关系、建立麦曲微生物生态数据库和麦曲品质的分子评价指标，具有重要的指导意义。
不同培养基进行真菌平板分离的结果
为了最大限度地分离出麦曲中的真菌，采用了三种培养基，其中PDA和CPK培养基是用来分离真菌的常用培养基，此外还使用了麦曲浸提液培养基（WQE），因为它的营养成份近似于微生物最原始的生存环境。对于三种培养基进行平板菌落计数，PDA和WQE培养基上的菌落数在48小时后达到最大，菌落数分别达到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CPK培养基上，由于本身是合成培养基，营养不够丰富，所以24小时后开始慢慢形成菌落，56小时后达到最大值，仅为1.4×104 cfu/g干曲。
不同培养基的麦曲真菌分布
根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，共得到24株纯种菌株。各个纯株在3种分离培养基上的分布情况见表1。从PDA，CPK和WQE三种培养基上分离得到的纯种真菌分别为8种、18种和11种。PDA是营养丰富的培养基，但分离出来的真菌数目最少。而近似于微生物最原始生存环境的WQE培养基分离得到的真菌种类，要比预期的少。在合成培养基CPK上分离获得的真菌种类最多，暗示在低营养长时间的培养条件下，能够较多地回收得到麦曲样品中的真菌。
将10—5稀释度以上检测到的真菌认为是麦曲样品中的优势菌。从表中可以看出，不同的培养基分离出来的优势菌是不一样的，且每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株，所以必须联合使用多种分离培养基，才能准确解析麦曲中的真菌多样性。另外，在分离培养基中有必要加入去氧胆酸钠来抑制菌丝的蔓延。
纯种真菌的鉴定
对分离获得的24株真菌纯株进行形态初步鉴定和基于ITS序列的分子鉴定，具体测序结果见表1。
综合平板分离和测序的结果可以看出，通过大规模的系统分离培养方法确定麦曲中的优势真菌为：伞枝犁头霉（Absidia corymbifera—like），米曲霉（Aspergillus oryzae）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黑曲霉（Aspergillus.niger）、小孢根霉（Rhizopus microsporus）、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、季氏毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和异常毕赤酵母（Pichia anomala）。
本研究分离鉴定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉（Aspergillus terreus—like）、泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、桔青霉（Penicillium citrimum）、季氏毕赤酵母、异常毕赤酵母，小孢根霉，多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）、球毛壳霉（Chaetomium globasum）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和Phaeosphaeria fuckelii等菌株在以前的研究结果中均未出现。所用的麦曲是人工脚踏成型，此前公司采用培养法对机制麦曲中的真菌进行过研究，机制麦曲中的优势真菌为伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。除了米根霉以外，其余优势真菌与本文的研究结果一致。
人工脚踏成型麦曲中的真菌种类比机械压制成型麦曲丰富，其原因是人工踩制曲坯能起到提浆作用，赋予曲坯表面较丰富的营养和较好的保温功能，因而比机械压制成型的曲坯更适合微生物的生长繁殖。
对分离获得的真菌纯株序列进行系统发育分析发现，所分离得到的纯种菌株大致分为11个属，分别是曲霉属（Aspergillus）、犁头霉属（Absidia）、根霉属（Rhizopusmucor）、毛霉属（Rhizopus）、青霉属（Penicillium）、散囊菌属(Eurotium)、枝孢属（Cladosporium）、毕赤酵母属（Pichia）、球毛壳属（Chaetomium）、念珠属(Candida)和伊萨酵母属（Issatchenkia），反映出绍兴黄酒成品麦曲中真菌的资源非常丰富。从属的分类水平来看，在脚踏曲中出现的属除了散囊菌属（Eurotium）、毕赤酵母属（Pichia）和球毛壳属（Chaetomium）外，其它的属在机制曲中均有出现。
本文所得到的序列用菌名加代号表示，来自于GenBank数据库的序列用菌名加登录号表示。比例尺代表5%的核酸序列差异性。
核糖体内转录基因间隔区
分析麦曲中真菌群落构成
免培养法提取麦曲中微生物总DNA显示了9条带，其中条带8、条带5、条带4 和条带3，亮度最高。免培养法指纹图谱中的条带，经过回收后的测序结果见表2。
采用分子生物学技术和传统培养富集法分析麦曲中真菌的RISA指纹图谱有明显的差异。免培养法指纹图谱中检测到的9条带，其中5条带所代表的微生物（Absidia corymbifera, Rhizomucor pusillus、 Aspergillus oryzae、 Emericella nidulans、Clavispora lusitaniae）通过培养法分离得到。对应于条带3，条带7和条带8的真菌热带假丝酵母（Candida tropicalis）、 米根霉（Rhizopus oryzae）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），通过分离培养法没有检出。
造成上述现象的原因可能是：
第一、所用培养基的选择性；第二、麦曲中其他真菌的抑制；第三、经过制曲过程中的高温选择后。这3种真菌在最终的成品麦曲中没有活细胞，但是用不辨别死活细胞的免培养法可以检测出来。另外，通过不同的分离培养基检测出的19株真菌通过免培养法未能检测到，可能是由免培养技术本身引起的。
据悉，一方面，在样品中的含量低于1%的微生物通过免培养法无法检测到，而这些含量比较低的微生物通过培养法可以检测到；另一方面，有些微生物在样品中的含量很少，但通过培养基富集后，其数量增加，以致于通过RISA技术被检测出来，从而在液态富集的指纹图谱中出现。